把细菌监管起来

1877年夏，科赫经常去布雷斯劳城柯恩博士的实验室。在共同的研究工作中，他们的友谊进一步加深。10月，他在那里结识了年轻的大学毕业生埃尔利希（Ehrlich P，1854－1915）。埃尔利希这个月在布雷斯劳大学通过了医学生国家考试，他常常向科赫请教细菌学研究方面的问题，后来成为科赫主持的传染病研究所中的主要助手，并成长为一名诺贝尔奖金获得者。

柯恩和科因海姆一直在努力帮助科赫，他们利用各种机会宣扬他的成就，并说，让这样一位科学家埋没在偏远的乡村小城，德国应该感到羞耻，他需要一个良好的科研环境和条件，以便能集中精力继续进行他的研究工作。而科赫关于炭疽病菌的论文，则使每一位读者，尤其是那些与科赫处境类似的私人开业医生，都受到了巨大的鼓舞。

全世界都开始注意科赫和他的工作了。1880年春，他被聘任为柏林帝国卫生局的成员。这样，他就可以不为谋生而为人看病，有了更多的时间和优良的设备进行细菌学的研究，得以更充分地发挥自己的才能。正是在这前后数年，科赫在细菌学技术方法的创造和改进方面做出了很大的成绩。

由于细菌的个体非常微小，而且又透明无色，所以即使采用当时最好的显微镜，也不能很清晰地观察到它们的形状，所以科赫一直想给细菌染上鲜艳的色彩，以便能容易地分辨它们。

当时在细胞学研究中已采用工业中的亚尼林染料给细胞染色。1877年，科赫开始将亚尼林染料转用于细菌的染色。他和热心于这项研究的埃尔利希一起，进行各种各样的实验。

他们将含有细菌的滴液标本抹在载玻片上，待涂片干燥、细菌固定后，加上染料进行染色，然后用火焰给玻片加温，以促使细菌着色。这些给细菌染色的方法，都属于首次创用。

最困难的莫过于后来给结核杆菌的染色。由于结核杆菌比炭疽杆菌要小得多——只有后者的1/10那么大，所以用平常的染料和方法，再使用放大数百倍的最好镜头，看到的也只是一个模糊的影子。

于是，科赫的实验室似乎成了出售染料的小店铺，桌子上、柜子里到处都堆满了五颜六色的瓶子。他尝试着用各色染料一一给标本染色，棕色的、绿色的、紫色的……他的双手给弄得像个染匠似的花花绿绿，手上的皮肤则因反复在二氯化汞杀菌液中浸泡而变得晦涩起皱。试过了几十种染料，结核杆菌仍然没有留下清晰的痕迹。科赫没有灰心，执著地更换染料进行实验。终于，他把标本放在一种叫做次甲蓝溶液中长时间浸泡后，再取出来用显微镜观察，这一次，细菌屈服了，穿上了不再褪色的蓝衣裳，显出了它们纤细的轮廓，可以清清楚楚地对它们进行研究了。科赫创用抗酸性染色法，终于使结核杆菌原形毕露。这时是1882年。其后，这种染色法又经埃尔利希改进后，长时间为微生物学家们所沿用。

结合细菌染色法的研究，科赫还开创了显微摄影术。在这以前，科学家们只能用文字或图画来说明、描述在显微镜中观察到的现象。显然，这很容易产生混乱，因为图画不可能描得十分精确。所以科学家们迫切希望用摄影技术来表达他们的研究成果。科赫先采用细菌染色法，使细菌在显微镜下清楚地显现出来。然后他使用特殊的聚光器、遮光板和放在液状脂肪中的透镜来给细菌照相。科赫研究成功的显微摄影术，有利于细菌形态学资料的比较和保存，为细菌学的深入研究提供了极大的方便，至今仍在应用。

研究细菌首先必须方便地取得细菌标本。如何能大量分离出单一纯种的细菌，是当时面临的又一个难题。

我们还记得，科赫在观察动物体外培养出的炭疽杆菌的生长繁殖情况时，为不受其他细菌的干扰，曾想出了一种富有独创性的方法。他是这样做的，取一张较薄的载玻片，加热灭菌后，在四周涂上一层薄薄的凡士林，再在载玻片中央滴上一滴混有死鼠脾脏的牛眼房水。然后，又取一张较厚的载玻片，在其中央磨出一个小凹窝，把凹窝对准并盖在较薄的载玻片中心有菌液处，使两片载玻片紧紧地粘在一起。最后，把这个装置反转过来，这时候较厚的载玻片在上，菌液悬于其凹窝中，就能在目镜下很方便地观察标本的情况。这就是科赫发明的“悬滴标本检查法”，至今作为一种不染色细菌标本检查法仍在运用。

但是，如果要想清晰地观察到各种各样的细菌，尤其是要想经常大量地取得纯种细菌。那这种方法不仅操作复杂，取用不便，而且培养的细菌数量也有限，不能满足需要。

科赫知道，细菌的生长繁殖必须要有充分的养料和适合的条件。当时人工培养细菌所用的营养物质（称为细菌培养基）都是液状物。科赫也曾根据不同种类细菌的嗜好，特地调制了各种美味的肉汤，让细菌在肉汤里充分吸取养料，又快又好地生长繁殖。可是，这样生长起来的细菌总是多种多样的，有的球形，有的棒状，混合在一起，很难分离。

“肉汤是液状物，各种细菌在里面自然容易自由游动：”科赫沉思着，在房间里来回踱步。“如果让细菌在固体物质上繁殖呢？这样一来，它们就不会自由游动，可以各自固定在一个地方生长繁殖，而不相混杂。”

想到这里，科赫记起了1872年德国科学家加勒德（SchrÖder H.G.F，1810－1885）所做的一个实验。施勒德曾用马铃薯斜切面作为培养基，发现其表面长有不同色素的菌落，并证实每一菌落只含有一种类型的细菌。可是，马铃薯所含的营养成分毕竟有限，不利于细菌的滋长。

“用什么作细菌培养基，才可以既能使细菌得到像肉汤那样的营养，又能使细菌像固定在马铃薯切面上那样不相混杂呢？”科赫为此绞尽脑汁，日夜苦思，常常连夫人埃米放在桌上的饭也忘了吃。

一天，在房间里踱步的科赫随意地将脚步停在了饭桌前，眼光不经意地掠过桌上的食物，脑子里仍在苦苦思索。突然，他死死地盯住了放在桌上的一盘肉汤。放凉了的肉汤已变成胶稠状。噢，凉了的肉汤就会凝冻！灵感的火花又一次闪过科赫的脑际。

“对，这是由于肉汤含有胶质的缘故！胶质越丰富，凝冻得就越结实。我何不试一试用动物明胶来做培养基呢！”

兴奋的科赫说干就干。他找来一些动物明胶，加上少量的水，把它们加热熔化，再往里加进一些牛肉汤，以增加养料，然后把这些混合物倒进几个大盘子中。不久，混合液凝固成了胶冻状的平板。科赫用一根曾在细菌混合液中浸过的金属丝在胶冻表面划下了一道道浅痕。果然，每一种细菌只固定在与胶冻接触的最初的一点，同时又只吸取着这一处的营养，生长繁殖起来。一小堆一小堆的细菌在胶冻平板上生长着，有的光滑、洁白，有的却似金黄色小茸球。这些菌落就是从一个细菌繁殖起来的细菌团，而一堆菌团中就只是单一纯种的细菌。

世界上第一个可以分离纯种细菌的半固体培养基在科赫手中诞生了，它对当时细菌的研究起了巨大的促进作用。后来，他在运用这一发明培养结核杆菌时又遇到了很大的困难。结核杆菌在各种肉汤胶冻里总不能生长。经过许多次试验，他又发明了著名的血清培养基。他到屠宰场弄来不少小牛血清，加热灭菌后装进试管，并将试管斜放，这样就有较大的血清表面，便于培养细菌。当血清凝结成半透明的黄色胶冻时，接种上豚鼠的结核组织，并使试管保持适宜的温度。就这样，他终于培养出了纯种的结核杆菌。

当科赫意识到胶冻细菌培养基这项新技术的重要性以后，决心再次向微尔啸请教。可是，这时微尔啸已作为柏林选区的议员加入了德意志帝国议会，并担任了在野党的领导人，只是由于中年以前的经历，才使他头上仍然笼罩着学术权威的光环。他需要的是对达到他的政治目标有用的人，因此对科赫仍然冷淡而疏远。这令科赫的心情沮丧而又气愤。然而，同样作为著名科学家的巴斯德却不一样。当1881年，科赫在英国皇家学院的实验室中演示了培养纯菌种的新技术后，尽管他曾在几年前发表过一些与巴斯德不同的观点，巴斯德还是走上前去，激动地对科赫说：“先生，这确实是一项伟大的进展！”

不过，科赫发明的这项新技术也还存在某些不足之处：由于明胶熔化点低，细菌培养的温度不能超过20℃，而有的细菌在这种情况下却生长缓慢；另外，有的细菌能分解明胶，使分离的细菌又重新混杂。1882年，科赫的学生赫斯（Hess W，1846－1911）受其夫人启发，改用海藻中的多糖提取物——琼脂替代明胶。琼脂在温度达到42℃时仍能保持固态，而且大多数病原菌不能分解琼脂。因此，用1.5％—2％琼脂固体培养基以分离细菌纯种技术之一。科赫的另一学生配替（Petri R.J，1852－1921）创用平皿来替代科赫采用的普通玻璃平板。这种平皿开放操作方便，通气，又能保持无菌状态。